高壓蒸汽滅菌法（autoclaving） 可殺滅包括芽胞在內的所有微生物，是滅菌效果好、應用廣的滅菌方法。方法是將需滅菌的物品放在高壓鍋（autoclave）內，加熱時蒸汽不外溢，高壓鍋內溫度隨著蒸汽壓的增加而升高。在103.4kPa（1.05kg/cm2）蒸汽壓下，溫度達到121.3℃，維持15～20分鐘。適用于普通培養基、生理鹽水、手術、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。
有下排式壓力蒸汽滅菌器和預真空壓力蒸汽滅菌器兩大類。下排式壓力蒸汽滅菌器又包括手提式和臥式兩種。 （1）下排氣壓力蒸汽滅菌器，下部有排氣孔，滅菌時利用冷熱空氣的比重差異，借助容器上部的蒸汽壓迫使冷空氣自底部排氣孔排出。滅菌所需的溫度、壓力和時間根據滅菌器類型、物品性質、包裝大小而有所差別。當壓力在102.97～137.30kPa時，溫度可達121～126℃，15～30分鐘可達到滅菌目的。
（2）預真空壓力蒸汽滅菌器，配有真空泵，在通入蒸汽前先將內部抽成真空，形成負壓，以利蒸汽穿透。在壓力105.95kPa時，溫度達132℃，4～5min即可滅菌。
（1）滅菌包不宜過大過緊（體積不應大于30cm×30cm×30cm），滅菌器內物品的放置總量不應超過滅菌器柜室容積的85%。各包之間留有空隙，以便于蒸汽流通、滲入包裹中央，排氣時蒸汽迅速排出，保持物品干燥。
（2）盛裝物品的容器應有孔，若無孔，應將容器蓋打開。
（3）布類物品放在金屬、搪瓷類物品之上。
（4）被滅菌物品應待干燥后才能取出備用。
（5）滅菌鍋密閉前，應將冷空氣充分排空。
（6）隨時觀察壓力及溫度情況。
（7）注意安全操作，每次滅菌前，應檢查滅菌器是否處于良好的工作狀態。
（8）滅菌完畢后減壓不要過猛，壓力表回歸“0”位后才可打開蓋或門。
